项目总结报告

一、研究主要内容及其研究思路

青藏高原地域辽阔，海拔高度居世界之首，常居的人口较大，随着国家西部大开发  策略的逐步实施和高原地区的城市化进程加快。居住人口也在逐步增加。近年来，如何  提高边疆地区人民健康是国家所关注的热点之一。近年来，由高原低氧环境导致的胃肠  道疾病逐渐被人们所关注，尤其在高海拔的偏远地区，胃肠道疾病的危害还相当严重[1]。 高原低氧环境对胃肠道疾病影响已得到了越来越多的认识。然而高原低氧环境对消化道  粘膜免疫系统的影响尚缺乏较为系统的研究。

低氧环境下消化道疾病，多见于急进高原人群，常产生恶心、食欲减退、腹泻等表 现，又称“高原胃肠应激综合征 ”。相关研究显示研究显示，短期暴露于缺氧环境的小 鼠，多个器官中的炎性细胞积聚增加[2]，也有研究显示，在健康的登山者中也检测到 血液中会有 IL-6、CRP 等炎性细胞因子的增加以及肠道运输蛋白、脂质代谢等的改变  [3,4]。此外，暴露于高海拔地区可能会导致胃和十二指肠糜烂及溃疡的形成，并可伴 有持续性的胃肠道出血[5-7]。

随着低氧时间的增加，消化系统主要以肠道菌群、黏膜屏障以及免疫系统的改变为 主。低氧对消化系统的研究相较呼吸、循环系统较少，因此，研究低氧对机体消化系统 的影响，对于更加了解机体对高原环境对的适应具有重要价值。机体正常的肠道黏膜屏 障主要包含有生物、机械、化学及免疫屏障，构成了机体抵御肠道病原体感染的首道防 线。

溃疡性结肠炎( UC )是炎症性肠病( IBD )的一种，主要表现为体重下降、腹痛、

血性腹泻和肠道屏障功能障碍伴炎症细胞浸润[8][9]。患者的这些症状可能会恶化，IBD  与一些合并症相关，可能包括心血管疾病发病率升高，炎症驱动的肿瘤扩张，以及相关  的情绪如抑郁和焦虑[10][11][12]。虽然炎症性肠病的确切发病机制尚不清楚，但环境  因素逐渐被内在地认识到。缺氧似乎是炎症的重要驱动力，生物建立适应机制以保证体  内平衡然而，在发生故障时，它会导致病理过程的扩大[13][14]。多项研究发现，在患  有高原疾病的患者中，炎症标志物如白细胞介素-6、C-反应蛋白和白细胞介素-8 的浓度  更高，提示缺氧在炎症中的重要作用[15][16]其他研究表明，在 4000 米以上的低压缺   氧环境中，动物海平面升高导致炎症细胞浸润增多，肠屏障破坏，显大量的细菌和有毒  化学物质转移到血液中的其他组织和反应产生的氧物种会引起局部氧的消耗[17][18]。 肠屏障障碍可能缺氧导致各种肠道疾病和众多器官功能障碍[19] .曝光众所周知，到高  海拔地区会导致胃和十二指肠的糜烂，从而导致胃肠出血的情况[20]炎症破坏肠道屏障， 使缺氧扩散到以前的现在必须适应这种情况的正常组织。

溃疡性结肠炎是一种炎症性肠病，其特征是结肠内出现溃疡。根据感染部位的变化， 科学地对胃肠道损伤进行了分类。如肠壁炎症的深度、病理生理的特点等。通常，结肠 末端与直肠有关[21]。溃疡性直肠炎局限于直肠，主要影响肠壁的粘膜层和粘膜下层。 它也可能发生在多个结肠区域，即使 UC 在某些情况下仅影响结肠的某些部分[22]。炎  症可能会不同程度地扩散到结肠上部。整个结肠感染称为全身性结肠炎。这种疾病的症 状会随着时间的推移而不是突然出现，包括间歇性直肠出血、绞痛性腹痛和腹泻[23]。 许多患者有很长的缓解期。溃疡性结肠炎在长期出现症状后，可以突然痊愈。

近年来的统计表明，溃疡性结肠炎是中国较为常见的消化道疾病，成为胃肠道疾病 研究的新热点。最新的 IBD、UC 和 CD 发病率分别上升到 1.80(IBD)、1.33(UC)和 0.46/1万(CD)，中国是世界上人口最多的大国，在地区和少数民族之间存在差异。例如，51  个少数民族居住在中国西南部的云南省，占少数民族总人口的 33.41%。流行病学资料显 示，18 个少数民族人群中汉族人 IBD 总发病率最高(9463/10 万)，其次为回族人口

(8563/10 万)、满族人口(7092 /10 万)和白族人口(5271/10 万)。UC 发病率最高的人群 为汉族(8,918/100,000)其次为回族(7,720/100,000)、满族(7,092/100,000)和白族

(5,083/100,000)。CD 以西藏少数民族患病率最高(1376 /10 万)，其次为回族(0842/10 万)和汉族(0545 /10 万)。[24]。作为一个人口众多、城市化和西部化进程迅速扩大以 及环境因素变化的国家，中国的 IBD 病例数量可能比以前想象的要高得多。中国大陆 IBD 的真正疾病负担不容小觑。现在是我们敲响警钟的时候了，未来的首要任务是登记不同 地理位置的 IBD 患者，并开展覆盖中国大陆大部分地区的全国性人群流行病学研究。

消化道黏膜免疫系统作为机体免疫调控重要组成部分在抗病原体感染方面起着重 要作用。树突状细胞（dendritic cells, DC）是机体免疫反应中最重要的特异性抗原 提呈细胞，其根据其细胞来源及表型的不同，分为髓系 DC（MDC, CD11c+ CD11b + CD8 α -）及淋巴系 DC（LDC, CD11c+ CD11b - CD8a +）。其在诱导 T 细胞的激活过程中起 到了关键的作用[25]，此外，还可产生不同细胞因子，发挥免疫调控功能。其中，IL-12 可促进Th1细胞亚群的增殖，而 IL-4 则促进 Th2 细胞亚群的分化增加。以往的研究表 明，MDC 更加倾向于诱导 Th2 细胞活化，而 LDC 可通过分泌高水平的 IL-12 和 IFN- γ ,  以促进 Th1 免疫反应[10]。

所以，树突状细胞的活化及功能状态是影响 Th 细胞分化的重要因素，同时也关系 到免疫应答效应的发挥。所以本项目以树突状细胞为研究对象，旨在探讨低氧对树突状 细胞分化的影响，以揭示高原低氧环境对机体抗病原菌感染的免疫反应机制。

细胞表面标记如 CD11c，CD11b，CD8a，CD4，MHC-II 和 CD45RA 等被最广泛地用于 DC 亚群的表型表征。所以我们首先分离、制备的肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node, MLN）、派尔氏结（Peyer's Patches）单细胞悬液进行细胞计数，确保每管细胞数达到 1 × 107 cells/ml。随后应用流式细胞仪检测不同树突状细胞分化亚群表面抗原标志

CD11c, CD8 α, CD11b，分析低氧对小鼠 DC 分化的影响，包括：髓系树突状细胞（myloid DC, MDC, CD11c+   CD11b + CD8 α -）、淋巴系树突状细胞（lymphoid DC, LDC,

CD11c+   CD11b - CD8 α +）。通过实验，我们探讨低氧对树突状细胞分化的影响，以 揭示高原低氧环境对机体的影响，为高原低氧地区肠道疾病提供重要的理论指导。

本实验研究高原低氧对硫酸右旋糖酐钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠粘膜树 突状细胞的影响。以揭示高原低氧环境对溃疡性结肠炎的影响。研究结果可以为高原肠 道疾病的救治提供重要的理论指导，也为青藏高原的经济及国防提供有力的卫勤保障。

研究实施简述步骤如下：

1、选择并建立模型

本实验选择硫酸右旋糖酐钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎模型，并建立低氧下结肠 炎小鼠模型。32 只雌性、8 周龄 SPF 健康级 BALB/c 小鼠（18-20g）[26]，将 32 只 Balb/c 小鼠随机分为四组，分别为：常氧对照组、DSS 诱导产生溃疡性结肠炎的常氧 DSS 组、 低氧对照组和低氧 DSS 组，常氧组饲养于咸阳（360m）；低氧组饲养于模拟海拔 6000 m 的实验动物低压舱中，低氧处理 8 天。

并于取材当天检测正常组及低氧组小鼠生理指标及血生化参数，包括肺动脉压

（pulmonary artery pressure, PAP）、心率（heart rate, HR），红细胞计数（red blood cell, Rbc）、血细胞比容（hematocrit, Hct）和血红蛋白（hemoglobin, Hb）。

2.2、后续实验

2.2.1 切片制备及 H.E.染色

为明确低氧是否对感染性结肠炎有影响，我们收集结肠进行 H.E.染色，并对其观察 进行组织病理评分：

组织病理学评分参照Haining Shi 等[27][28]建立的一种改良评分系统，此系统由 两部分组成，第一部分是对组织炎性细胞浸润程度的评价，第二部分是对组织损伤程度 的评价

2.2.2 流式细胞术（FACS）检测

为了探究低氧是否通过影响树突状细胞分化，进一步影响消化道黏膜免疫反应，我 们进行流式细胞术（FACS）检测

（1）收集肠系膜淋巴结（MLN）、派尔氏结（Peyer's Patches），分离、制备单 细胞悬液

（2）应用流式细胞术（FACS）检测树突状细胞（Dendritic cells, DC）不同分化 亚群表面抗原标志CD11c, CD8 α, CD11b，分析低氧对小鼠 DC 分化亚群的影响。包括髓 系 DC（MDC, CD11c+ CD11b+ CD8 α-）及淋巴系 DC（LDC, CD11c+ CD11b- CD8a+）。

PS：技术路线图如下

二、研究结果

（一）溃疡性结肠炎小鼠模型建立

将 32 只 Balb/c 小鼠随机分为四组，分别为：常氧对照组（NC）、常氧 DSS 组（ND）、 低氧对照组（HC）和低氧 DSS 组（HD），常氧组饲养于咸阳（360m）；低氧组饲养于模拟 海拔 6000m 的实验动物低压舱中，低氧处理 8 天。

2.1 小鼠生理指标变化

2.1.1 体重：

图 1   A 图实验组体重变化                B 从实验第一天到最后一天的体重变化量

如图 1 所示，较两对照组相比与之相对的 DSS 组体重均低于两组对照组；与常氧 DSS 组相比低氧 DSS 组体重下降幅度更大。

2.2 血液生化检测

表 1 生化指标变化（mean±SD, n=8）

低氧作为高原环境最主要的特征，可引起一系列生理机能的改变。红细胞增多症是低氧 应激的常见反应，红细胞代偿性增加会致血液粘度和血细胞比容值相应增加。为证实低氧模 型的建立并收集血液分析血液学生化参数，包括红细胞计数（Rbc），血细胞比容（Hct）和 血红蛋白含量（Hb）变化。表 1 结果显示，低氧处理 2 周后，低氧组小鼠 PAP 、Hct 、Hb 较 对照组明显升高。

2.3 疾病活动指数（DAI）

每天检查小鼠粪便变化，通过计算疾病活动指数（DAI）来评估结肠炎的严重程度， 如表 2 所示

表 2 疾病活动指数评价量表（DAI）

图 3 常氧 DSS 组 

图 4 低氧 DSS 组

图 2 显示了小鼠粪便粘稠度、可见血、直肠出血的严重程度评分(量表见表 2) 。低 氧 DSS 组和常氧 DSS 组小鼠从第 4 天开始疾病活动指数逐渐升高，并在最后 2 天显示疾 病的严重程度。可以看出，常氧 DSS 组的严重程度指数>2,低氧 DSS 组的严重程度指数>3。 此外，在图 3 ，4 中，显示常氧 DSS 组和低氧 DSS 组出现便血。

（二）低氧暴露对 DSS 诱导的溃疡性结肠炎的影响

2.1 组织学检测

图 5 各实验组小鼠结肠长度比较

图 7 各组病理学检测

表 3  各实验组结肠平均长度

实验小鼠结肠分离、拍照，实验终止后测量。如图 5 所示，为结肠肉眼观检查显示，如 表 3 所示，经计算低氧 DSS 组小鼠结肠缩短明显,常氧对照组小鼠的平均结肠长度最长，超 过 9cm，而低氧 DSS 组小鼠的平均结肠长度最小，为 6.7cm。如图 7 所示，病理学检测显示， DSS 组小鼠结肠组织病理改变轻微，上皮轻微水肿，细胞排列正常；而常氧 DSS 组小鼠结肠 则表现出典型的病理改变，包括上皮水肿，炎性细胞浸润，隐窝增生等。低氧 DSS 组小鼠以 上病理改变最为严重，且部分黏膜正常组织结构少许破坏，病理学评分同时显示低氧 DSS  组小鼠表现出更为严重的炎症状态。

2.2 FACS 检测

派尔氏淋巴结

图 8    FACS 分析派尔氏淋巴结单细胞悬液 DC 不同分化表型的表达（mean±SD, n=5-8/group; # p < 0.05 vs. Normal+Control; * p < 0.05 Normal vs. Hypoxia）

肠系膜淋巴结

图9 FACS 分析 MLN 单细胞悬液 DC 不同分化表型的表达（mean±SD, n=5-8/group；# p < 0.05 vs. Normal+Control; + p < 0.05 vs. Hypoxia+Control; * p < 0.05 Normal vs. Hypoxia）

树突状细胞（DC）根据其细胞来源及表型的不同，分为髓系 DC（MDC, CD11c+ CD11b + CD8 α -）及淋巴系 DC（LDC, CD11c+ CD11b - CD8a +）。本研究中，我们通过收集 各实验组小鼠肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node, MLN）、派尔氏结（Peyer's

Patches），制备单细胞悬液，应用流式细胞仪检测 DC 的不同分化亚群，图 8、9 结果 显示，DSS 组小鼠 LDC 亚型（CD11c+ CD11b - CD8a + DC）增多较明显，而低氧 DSS 组 小鼠 LDC 则有所降低。以上结果表明，低氧暴露诱导小鼠淋巴系树突状细胞（LDC, CD11c+ CD11b- CD8a +）亚型分化明显降低

三、主要特色和创新点

1、高原低氧环境对于机体及其相关的生理机能的影响，对于呼吸、神经、循环系  tong等的相关研究较为完备，而高原低氧环境对机体免疫系统的影响机制，仍未有系统 的阐述，本项目以消化道的粘膜免疫作为切入点，探究低氧对机体免疫系统的影响机制。

2、本项目选择参与免疫反应最主要的抗原呈递细胞——树突状细胞（dendritic  cells, DC）作为研究对象，以揭示高原低氧环境对机体抵抗能力的影响，为高原地区 的肠道疾病提供新的治疗靶点。

3、实证分析与案例研究的结合：我们通过对小鼠高原模型等典型案例的深度剖析 和实证研究，验证了项目成果在实际应用中的效果，实现了理论研究与实践应用的紧密 结合。

四、项目成果应用情况或应用前景

A、研究可带来的经济效益

该研究可以为治疗结肠炎寻找新的药理学靶点，给制药公司的药物开发提供理论支 持，增加制药公司在行业竞争力，后期进一步的验证如果该靶点为特异性靶点，制药公 司还可以开发出用于诊断易患特定疾病的人群的生物标志物及预防药物。除此之外把疾 病与靶标更清晰地联系起来有利于开发出用于诊断特定疾病的生物标志物,从而减少误 诊率。在市场上抢占优势地位，给公司带来可观的收益。

B、市场分析

1、市场基本情况

近年来，对分子科学理解和应用的增多,以及计算机应用能力的巨大进 步使制药公 司开发用于治疗特定疾病亚型的药物成为可能，为了开发出与传统的 ”理想 ”药物不同 的新药制药公司必须采用不同的研究策略特别是随着分子科学发展,靶标的种类和数量 在增多,研究范围必须包括生物药物分子科 学虽然不能立即促进新药的大量出现但是  可以使制药公司更精确地对疾病进行定义和分类，从而开发针对各种疾病亚型的药物. 目前,该方面的研究主要 10 包括哮喘及癌症等,并主要集中在特定疾病亚型的发病机制 和分子机制。在 高原环境下的结肠炎的治疗还没有相应的生物技术方面的药物

生物医药行业作为我国战略性新兴产业之一，既是生物技术最重要的应用方向，又 是现代医药行业转型升级的关键所在。在常态化疫情防控下，伴随着“健康中国 ”建设 等新机遇，我国生物医药行业发展的重要性与迫切性愈发凸显，正快速由最具发展潜力 的高技术产业向高技术支柱产业发展。近年来我国生物医药行业高景气发展，预计市场 规模将于 2025 年超过 8000 亿元，年均增速超过 20%。

生物医药行业是国家战略性新兴产业，也是医药行业的重要组成部分。从地区分布 来看，我国生物医药行业主要上市企业分布在长三角、珠三角以 及京津冀地区。广东 省含达安基因、凯普生物、康泰生物等代表性企业;上 海含上海莱士、复星医药、科华 生物等代表性企业;浙江含迪安诊断等企业; 北京含天坛生物、利德曼等企业;江苏和河 南分别含药明康德和华兰生物等代表性企业。

医药行业市场份额，从疫苗领域来看，按批签发量统计，中国疫苗领域 批签发量  集中度不高，其中，中生集团疫苗批签发量占比最高，为 18.7%， 包含旗下成都、上海、 兰州、北京等制所;第二位是沃森生物，2020 年批签 发量占比 6.9%。

医药行业市场份额，从血液制品领域来看，主要产品包含人血白蛋白、 免疫球蛋 白、人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物和人纤维蛋白原。按批签发 量统计，2020 年我 国生物医药行业以天坛生物批签发量数量最多， 占比高达 31.6%;其次是上海莱士，批 签发量占比为 16.1%。

2、中国生物医药行业竞争状态总结

从五力竞争模型角度分析， 目前，我国生物医药行业属于战略新兴产 业，且大多 属于国资背景，替代品威胁较小;现有竞争者数量不多，疫苗领 域市场集中度较高，其 他领域市场集中度有待提升;上游供应商一般为研发外包、独立实验室等企业，议价能 力适中，而下游消费市场主要是药店、医疗机构等，议价能力较弱;同时，因行业存在 严格的准入资质以及资金、技术门槛较高，潜在进入者威胁较小。

3、未来市场发展趋势

生物制药技术与人们的日常生活密切相关，其相比于传统制药技术的优 势不可小  视。随着生活水平的提高，人们对生命安全和身体健康的要求逐渐 提高，这将不断推  动着生物制药技术的发展。如今，我国的生物制药技术发 展水平越来越高，在研究基  础药物以外，还将深入到人体遗传物质中，试图明确更多疾病的致病机理。我国从事相 关领域的专业人员逐渐增多，但是本专业领域的精英人才实属稀缺，在借鉴国外先进经 验的同时，我们还需不断努力，为以后的研究提供基础。从目前的医药行业的发展趋势 来看，生物制 药技术的发展应重视药物的治疗效果、更高的人体贴合度和更小的副作  用。 随着我国在全球生物医药产业发展格局中逐渐从落后变为追赶，我国也 迎来了生 物医药产业的黄金发展期，医药创新能力已从全球第三梯队进入到第二梯队。这一阶段， 生物医药行业市场规模逐渐扩大，资金流入逐年增加。创新市场迅速扩张，仿制跟随走 向源头创新趋势明。

五、对今后工作的意见建议

1、加强宣传和引导：让更多学生了解大创项目的意义和价值，提高参与积极性。

2、提供更多资源：增加技术、实验设备、场地等资源，保障项目顺利开展。

3、完善导师制度：加强导师队伍建设，确保导师能给予学生充分指导。要求导师 要有专业知识和技能，创新思维，指导能力，沟通能力，团队协作能力，评估和反馈能 力，责任心。能够清晰地指导学生，帮助他们解决问题，能够启发学生的创新意识和思 维，认真负责地对待学生的项目，引导学生学会团队协作并准确评估学生的进展并给予 建设性的反馈。

4、强化培训和交流：组织培训活动，提升学生的创新能力；举办交流活动，促进 不同项目团队之间的交流与合作。

5、建立评估机制：对项目进行科学评估，及时反馈问题和改进建议。

6、鼓励跨学科合作：打破学科界限，促进多领域知识融合。

7、关注成果转化：为学生创造条件，推动项目成果的实际应用和推广。